科研试剂

用途

PCR、RT-PCR

说明

本酶是来源于高度嗜热菌Thermus thermophilus HB8的耐热性DNA 聚合酶，经大肠杆菌表达生成的重组型酶。
本酶具有逆转录活性，该活性在Mn²⁺存在的情况下会得到强化。利用该性能，可以用同一酶在同一试管中进行逆转录反应和PCR反应。
另外，本酶耐热性比Taq DNA 聚合酶高，对GC含量丰富的目的片段的扩增效率更出色。

特征

●高效率
与Taq DNA聚合酶相比，该酶对GC含量丰富的目的片段及粗样品的扩增效率更出色。

●可用1酶体系完成RT-PCR
由于本酶在Mn²⁺存在条件下显示RTase活性，只用本酶即可完成 RT-PCR。
且本酶在60℃时可进行RT反应，因此适用于GC含量丰富的目的片段、容易形成高级结构的目的片段的扩增。

实验例

1.使用Tth DNA Polymerase进行基因组PCR扩增

使用本酶，以50ng人的基因组为模板，进行PCR扩增长度180bp〜1.3kb的目的片段。
结果可见，各模板都得到了良好的扩增。

使用本酶可对各种目的片段进行PCR扩增。

2. 使用rTth DNA Polymerase进行RT-PCR的实验例

使用本酶，以酵母Total RNA 1μg为模板，对actin(目的片段长180bp和300bp)进行RT-PCR、以及分别以人的Total RNA(100pg、10pg)对易于形成二级结构的18S rRNA(380bp)进行RT-PCR。
另外，对18S rRNA使用M-MLV RTase + Taq DNA Polymerase进行RT-PCR并进行了比较。

RT反应条件
含有0.2mM dNTPs、1mM MnCl₂、Reverse Primer 2pmoles/μl、10U RNase Inhibitor及 5U rTth DNA Polymerase的RT Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.3)、90mM KCl)20μl反应液，60℃、30min.进行反应。

PCR条件
按1×浓度添加10×Chelating Buffer(100mM Tris-HCl(pH8.3)、1M KCl、7.5mM EGTA、0.5% Tween20)，然后添加Forward Primer，使终浓度0.4pmoles/μl、MgCl₂，使用终浓度为1.88mM，以终体积100μl的反应体系进行循环。

结果显示，可以得到良好的RT-PCR结果。另外，可以确认：以易于形成二级结果的rRNA为模板进行RT-PCR，60℃条件下进行RT反应的rTth DNA Polymerase比在42℃条件下进行RT的M-MLV RTase能得到更强的扩增效果。
这次虽然是使用的rTth DNA Polymerase，但是使用Tth DNA Polymerase也没有问题。
另外，一步法反应中进行RT和PCR反应时，推荐使用本酶的试剂盒「RT-PCR Quick Master Mix」。

参考文献

1) T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)
2) K. Yamada et al., J. Biochem.(Tokyo), 130: 335-340(2001)