科研试剂

用途

1链cDNA的合成

说明

RNaseH活性在cDNA合成中，会分解作为模板/引物的DNA-RNA杂交体中的RNA，导致反
应效率下降。而本酶可降低该RNaseH活性。ReverTra Ace^®通过在M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) RTase基因的RNaseH活性结构域导入点突变，降低了该活性。
另外，RNA的高级结构会阻碍RTase反应的进行，使得cDNA合成困难。本酶通过在DNA合成结构域导入点突变，提高了反应效率及高温反应性能，所以可在高温下进行反应。因此，可通过提高反应温度来缓和模板RNA的高级结构，可促进RTase对cDNA的合成反应。

另外，本酶比原有的deletion型M-MLV RTase RNaseH−相比，高出其约4倍的活性，可高效率地进行cDNA合成。

特征

●提高了延伸性
去除了M-MLV RTase的RNaseH活性，延伸性有了明显的提高。

●提高了反应效率・高温反应性
通过在M-MLV RTase的DNA合成区域中导入点突变及改良反应组分，提高了高温反应性和反应效率。

●*适合于RT-PCR
可在各种条件下进行逆转录反应，特别适用于RT-PCR。

原理

实验例

1.  42〜60℃时的cDNA合成反应
以带有poly(rA) Tail，长度分别为9.49、7.46、4.40、2.37、1.35kb的RNA 0.4μg为模板，以oligo(dT)₂₀ 25pmoles为引物，在42〜60℃的反应条件下，用本酶100U，进行30min.的cDNA合成反应。

结果显示，用ReverTra Ace，在42℃及50℃时生成了9.49kb、55℃生成了4.4kb、60℃生成了2.37kb的cDNA合成产物。

2.  cDNA合成效率的比较
以在in vitro条件下合成的G3PDH的RNA 10²〜10⁵copies为模板，使用G3PDH的下游引物，42℃、20min.进行cDNA合成反应后，加入G3PDH上游引物，用rTaq DNA Polymerase(Code No.TAP-201)进行PCR反应。
结果可见，用ReverTra Ace，即便是以10²copies的RNA为模板合成的cDNA为模板，也可确认到扩增产物。

3.  14kb的cDNA合成反应
以Human骨骼肌poly(A) RNA为模板，使用dystrophin mRNA的3'端的特异性cDNA合成用引物，42℃、30min.进行cDNA合成反应后，使用mRNA的5'端特异性PCR引物对（位于cDNA合成引物上游14kb处），用KOD Dash(Code No.LDP-101) 进行PCR，判断有无延伸。
结果可见，使用ReverTra Ace，可合成14kb以上的cDNA。

参考文献

1)K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226(2003)
2)A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66(2002)
3)S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246(2002)
4)S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460(2001)
5)Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675(2000)
6)S.Lee et al.,Gene,245:253−266(2000)
商品使用文献
1)T. Ikeda et al., Endocrinology 142(4): 1419-1426.(2001)
2)S. Ohuchi et al., Nucleic AcidsResearch, 30(15): 3473-3480.(2002)
3)K. Minami et al., ToxicologicalSciences 87(1): 296-305.(2005)